質問の順序を変えてお答えしましょう．

質問(総括)　学校でブロッコリーをサンプルにして同じ方法で測定を行い，興味を持ったので，今度は生体試料で…と思い，調べているうちにこの本にたどり着きました．が，読んでもその試薬を加えることで何が起こっているのか全く想像できません！

回答　ビタミンC (化学名: アスコルビン酸) は2,4-ジニトロフェニルヒドラジン(この本では単にヒドラジンといってますが別化合物です．レポートでは正式名で書くことをお薦めします) とは反応しないが，アスコルビン酸の酸化で生じるデヒドロアスコルビン酸はジニトロフェニルヒドラジンと反応して呈色する(着色化合物になる)，2,3-ジケト-L-グロン酸も同様に呈色する： これが測定法の原理です．
　溶血し除タンパクしただけで遠心してジニトロフェニルヒドラジンを加えれば，デヒドロアスコルビン酸とジケトグロン酸だけが反応して呈色します．これがあなたの質問の酸化型Vcのことですが，ジケトグロン酸による呈色も含まれていることに注意．あらかじめ2,6-ジクロロインドフェノールを加えてアスコルビン酸をデヒドロアスコルビン酸に酸化しておけばジケトグロン酸と一緒に呈色します．これが総Vcのことで，実際は[アスコルビン酸＋デヒドロアスコルビン酸＋ジケトグロン酸]による呈色の合計です．はじめにDTTを加えてデヒドロアスコルビン酸をアスコルビン酸に還元しておけば，ジケトグロン酸だけが呈色します．

　　　　　酸化型Vc−ジケトグロン酸＝デヒドロアスコルビン酸

　　　　　総Vc−酸化型Vc＝アスコルビン酸

これで全部測定できたことになります．

質問(1)　なぜ総Vc・酸化型Vcの測定で用いるサンプル(血液)の量がそれぞれ2.2，2.3 mlと，異なっているのですか？

回答　サンプル血液の量は総Vc，酸化型Vcとも0.3 mLと同じです．しかし加える水の量が総Vcでは2.2 mL，酸化型Vcでは2.3 mLとなっています．後で加える試薬が違うので，全部加え終われば最終混合物は全部3.6 mLと同じになります．p.138の表で確かめて下さい．

質問(2，3)　総Vcの定量で，なぜメタリン酸を2度加えるのですか？ 塩化第一スズを加えるのは何のためですか？

回答　メタリン酸は除タンパク，つまり測定の邪魔になるタンパクを沈殿させて取り除くために加えます．確実に除タンパクするには，この実験条件では0.6 mLのメタリン酸が必要だと，この実験の考案者は結論したのでしょう．除タンパク操作では赤血球から出てきたヘモグロビンも沈殿します．ヘモグロビンはO₂を結合し血流に乗って体の隅々までO₂を配達するタンパクですから，血液サンプルのヘモグロビンのかなりの部分はO₂を結合した状態(オキシヘモグロビン)です．これがメタリン酸で沈殿するときO₂を放し，そのO₂がアスコルビン酸をデヒドロアスコルビン酸に酸化します．塩化第一スズ(SnCl₂)はO₂によるアスコルビン酸の酸化を防ぐ還元剤です．だから酸化型Vcを測定するときにはSnCl₂を加えて，血中のアスコルビン酸がデヒドロアスコルビン酸にならないようにします．そうでないとデヒドロアスコルビン酸の量が多めに測定されてしまいます．

一方，総Vcの定量では，最初にアスコルビン酸に2,6-ジクロロインドフェノールを加えてデヒドロアスコルビン酸に酸化しておきますが，余ったジクロロインドフェノールの色が測定の邪魔になるので，これもSnCl₂で還元して消します．このため，まずメタリン酸を0.3 mL加えて酸性にした上でSnCl₂を加え，他のサンプルで加える0.6 mLのメタリン酸に揃えるため不足分0.3 mLを後で追加します．詳しいことは分かりませんが，この実験法の考案者はメタリン酸を一度に加えず2回に分け，その間にSnCl₂を加えるのが正確な測定に一番よいということを，何度も実験して確かめたのではないでしょうか．

質問(4，5)　総Vc・酸化型Vcで，遠心分離をかける前にDTT液を加えるのはなぜですか？ ジケトグロン酸にDTTを加えた後，室温で10分放置するのは何の為ですか？

回答　ジケトグロン酸を測定するときは，デヒドロアスコルビン酸を還元してアスコルビン酸にする必要があり，最初にDTT (ジチオトレイトール)を加えます．この反応は，入れた途端にすぐというわけには行かないので，10 min待ってサンプル中のデヒドロアスコルビン酸を完全にアスコルビン酸に変えます．長く待ちすぎると別な反応が起こるかもしれないので10 minという時間は正確にしましょう．この方法を考案した人は，何min待つのが一番正確な測定結果を与えるか，何度も実験して決めたはずです．血液中のデヒドロアスコルビン酸は非常に少ないので大部分のDTTは反応せずに残っています．ところが総Vc，酸化型Vcを測定するときにはDTTを加えません．そこで最終混合物の組成を同じにするために最後にDTTを加えます．このときの混合液の条件ではデヒドロアスコルビン酸はDTTで還元されないので化学反応とは関係ありません．最終混合物の組成を揃えるためだけです．

質問(6)　サンプルは水に入れて完全に溶血させると書いてありますが，これは遠心分離にかけずにそのまま使用していいのですか???

回答　血液の赤い色は赤血球という細胞の中のヘモグロビン分子のためです．その他，白血球とかいろいろな細胞が含まれています．水を加えて溶血というのは，赤血球をはじめ，いろいろな細胞を壊し，中の成分を溶け出させることです．これにメタリン酸を加えればタンパクは沈殿します，といっても底に沈むのではなく，水に溶けなくなって溶液の中をただよい濁るだけです．濁ったままでは正確に測定できないから遠心は必要です．溶血とは血液中の各種細胞が壊れることで，透明な液体になることではありません．

　呈色したサンプルの色の濃さ(吸光度)からアスコルビン酸の量を計算するためには，血液の代わりに純粋なアスコルビン酸の溶液を使って，どの程度に呈色するか吸光度を測定しておく必要があります．この操作を《検量線をつくる》といって，これがないと正確に測定できません．本を見ながら丁寧に実験して下さい．なお，この本のp.138に《…硫酸をゆっくり添加する．ピペットで添加する自信がなければビュレットを用いるとよい．》と書いてありますが，どんなに自信があってもピペットでの添加は厳禁，非常に危険です．失敗すれば大怪我くらいではすまないかも．実験結果も教えて下さい．

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　T. Yagi